NGS-basierte Diagnostik: Was kann sie? Was kann sie (noch) nicht?

Neue Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung (next generation sequencing, NGS) haben die molekularpathologische Routinediagnositk in der Onkologie revolutioniert. Mit dieser modernen Sequenzierungstechnologie ist es möglich, molekulare Biomarker schnell und kosteneffizient zu testen, um sowohl die Diagnose zu sichern als auch prognostische bzw. prädiktive Marker zu bestimmen. Die Möglichkeiten und Limitationen der NGS-basierten Diagnostik beschreiben Prof. Dr. Katharina Tiemann und Dr. Markus Falk, Institut für Hämatopathologie Hamburg, in einem Übersichtsartikel.*

Die Liste der diagnostisch, prognostisch und prädiktiv relevanten Mutationen wird immer länger – tumorgenetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (polmerase chain reaction, PCR) oder Sanger-Einzelsequenzierung können diese vielen molekularen Biomarker nicht mehr bewältigen. Die NGS-basierte Diagnostik ermöglicht es, Einzeluntersuchungen in Panels zu bündeln und sehr große Gene zu untersuchen, und damit zeitnah und kostengünstiger Sequenzierungen durchzuführen. Das kommt letztendlich den Patienten zugute, weil so nicht nur rascher die Diagnose feststeht, sondern auch schneller die Prognose abgeschätzt, eine Therapie angepasst oder eine geeignete Therapie ausgewählt werden kann.

Zeitnahe Daten für eine optimale Patientenversorgung

Im Institut für Hämatopathologie Hamburg wurde beispielsweise ein NGS-Panel entwickelt, mit dem parallel 17 therapeutisch relevante Gene bei insgesamt 20 Patienten mit Lungenkrebs auf Punktmutationen sowie kleineren Insertionen und Deletionen untersucht werden. Die Testung mit diesem Lungenpanel dauert zehn Werktage, mit der herkömmlichen Sanger-Sequenzierung wären dafür etwa 2.000 Einzelsequenzierungen und mehrere Monate nötig. Ein weiteres Beispiel für den Vorteil der NGS-Panel sind Mutationen in den DNA-Reparaturgenen BRCA1 und BRCA2, mit deren Nachweis beim Ovarialkarzinom eine Therapie mit dem PARP-Inhibitor Olaparib indiziert ist. Mit den früheren Methoden wären für die 50 Exons der beiden Gene 50 PCRs gefolgt von 50 Einzelsequenzierungen nötig gewesen, was pro Patientin mehrere Wochen in Anspruch genommen hätte – mit der NGS-Sequenzierung kann alles innerhalb von etwa 10 Werktagen gleichzeitig untersucht werden

NGS macht Liquid Biopsy möglich

Die Sensitivität der klassischen NGS-Sequenzierungen liegt derzeit noch bei 3-5%. Mittlerweile gelingt es, mit einer bioinfomatischen Artefaktbereinigung (Herausrechnen von DNA-Duplikaten und Sequenzierartefakten) oder einer höheren Abdeckung relevanter Genabschnitte die Nachweisgrenze auf bis zu 0,1% zu senken. Das ebnete der Weg für die „Liquid Biopsy“ – dem Nachweis von Mutationen im Blut zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA). Diese ctDNA sind kurze (ca. 170 Basenpaare) DNA-Fragmente, die von Zellen solider Tumoren in geringer Menge ins Blut abgeben werden. Bei Patienten mit beispielsweise Lungenkarzinom ist in 20% der Fälle mutierte ctDNA gar nicht im Blut nachweisbar und bei den anderen Patienten liegt sie durch Verdünnung mit unmutierter DNA gesunder Zellen bis zu einem Anteil von weniger als 1% vor.

Die Liquid Biopsy wird in der Rezidivanalyse beim metastasierten Lungenkarzinom nach einem klinischen Progress unter einem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) eingesetzt, um die richtige Folgetherapie für den Patienten auszuwählen. Mit dieser nicht-invasiven Methode ist es möglich mit hoher Genauigkeit TKI-Resistenzmutationen wie die T790M-Mutation im EGFR( epidermal growth factor receptor)-Gen zu bestimmen. Mittlerweile ist die Liquid Biopsy Testung sogar im Rahmen des EBM abrechenbar.

Mit „hybrid-capture“ NGS noch mehr Möglichkeiten

Um möglichst viele der relevanten Resistenzmutationen aus limitiertem Material noch genauer zu testen, sind umfassendere NGS-Panels nötig. Mit der „hybrid-capture“-NGS, einer Weiterentwicklung der klassischen NGS, ist das auf den gleichen Sequenziergeräten möglich. Die klassische NGS ist Amplicon-basiert, d.h. die Anreicherung der Zielregionen wird mit einer PCR durchgeführt. Die hyprid-capture-basierte NGS reichert die Zielregionen in einem Hybridisierungsschritt mit RNA-Sonden an. Damit können praktisch sämtliche in der Literatur beschriebenen genetischen Tumoraberrationen, d.h. Punktmutationen, Translokationen und Genamplifikationen, parallel an einer Probe untersucht werden, aber auch bisher unbekannte Fusionsgene mit unbekannten Translokationspartnern. Um diese große Datenmenge auszuwerten, sind allerdings sehr große Serverkapazitäten nötig, was neben den umfassenderen NGS-Panels ebenfalls die Kosten erhöht. Weitere Vorteile der hybrid-capture NGS ist der Wegfall der FISH(Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)-Analyse und die Möglichkeit, die Tumormutationslast (tumor mutational burden, TMB) zu messen. Für die TMB müssten mehr als 100 Gene auf somatische Mutationen untersucht werden, was nur mit der hybrid-capture NGS möglich ist. Die TMB gilt seit kurzem als prädiktiver Marker für das Ansprechen einer Immuntherapie mit PD-1/PD-L1-Inhibitoren, wird jedoch aufgrund der hohen Kosten noch nicht in der Routinediagnositk angeboten.

Gute Kooperation gefragt

Neben den Herausforderungen der neuen Technologie wie hoher Aufwand in der Bioinformatik und für die Datensicherheit, ist auch eine enge kooperative Zusammenarbeit zwischen Pathologen und Molekularbiologen nötig. Nur mit dieser Koperation ist es möglich, molekularpathogene Genvarianten von den zahlreichen nicht-molekularpathogenen „single nucleotide polymorphisms“ (SNPs) zu unterscheiden und als Information für die Ärzte und Patienten aufzuarbeiten.

Vorteile	Nachteile
Zeitnahe Sequenzierung großer Gene	Teilweise große Mengen Ausgangsgewebe nötig
Zeitnahe Sequenzierung von Gen-Panels	Erheblicher Laboraufwand
Zeitnahe Daten für eine optimale Patientenversorgung	Noch erheblicher bioinformatischer Aufwand
Insgesamt kostengünstiger als Einzelsequenzierung	Mutationsinterpretation?
	Datensicherheit?
Vor- und Nachteile von NGS-Panel-basierter molekulargenetischer Testung.

*Tiemann K, Falk M. Jatros Hämatologie & Onkologie 7/2017:62-64